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[면역검사법] ELISA 개발 가이드 : [1] ELISA 플레이트 코팅 [2] 항원-항체 [3] 컨쥬게이트/표지 [4] 효소 & 발색 기질
인성크로마텍(주)
Date : 2020.01.02

 

ELISA 개발 가이드 (ELISA Development Guide)


본 자료는 ELISA 분석 개발 시 고려되는 4가지 필수적인 요소에 대해 서술되어 있습니다.

 


  •  ELISA 플레이트 코팅 방법 (ELISA plate-coating strategy)

  •  항원 및 항체 선별 (Antigen resources and antibody pairs)

  •  컨쥬게이트/표지 방법 (Conjugating/labeling strategy)

  •  효소 및 크로모겐 (Enzyme and chromogen) 

 

 

1.  ELISA 플레이트 코팅 방법 (ELISA plate-coating strategy)


특정 항원(specific antigen)에 대한 새로운 ELISA를 개발할 때 첫 번째 단계는 고정 방법(immobilizing strategy)을 결정하고 항원 또는 포획

항체(capture antibody)에 대한 플레이트 코팅(plate coating) 조건을 최적화하는 것입니다. 일반적으로 ELISA의 고체상으로 폴리비닐

(Polyvinyl) 또는 폴리스타이렌(Polystyrene) 물질이 적용 된 96 / 384-well 플레이트를 사용하지만 그 밖의 다양한 고체상 물질이 사용될 수 

있습니다. (표 1. 참조) 

 

 

표 1. 면역분석에 사용되는 고체상 종류

ELISA_고체상.PNG


고정화(Immobilization)는 분자 (항원 및 항체)가 표면에 부착되어 이동성(mobility)의 감소 또는 손실 되는 것으로 정의 될 수 있습니다. 

단백질이 고정되는 방식에 따라 ELISA의 특성이 결정 됩니다. 일부의 경우, 고정화 과정에서 단백질의 무작위적인 방향(random orientation)

혹은 구조적 변형(structural deformation)으로 인해 단백질의 활성이 부분적으로 없어지거나 완전히 없어지는 경우가 발생 되기도 합니다. 

생물학적 활성(biological activity)를 완전히 유지하기 위해 단백질의 형태와 기능에 영향을 받지 않으면서 단백질이 표면에 부착 되어야 

합니다. 일반적으로 표면 및 단백질의 물리화학적(physicochemical) & 화학적(chemical) 특성이 고려된 적합한 고정화 방법을 선택해야 

합니다. 지난 몇 년 동안 많은 고정화 기술이 물리적(physical), 공유(covalent) 그리고 생체 친화성 고정화(bioaffinity immobilization)의 

3가지 메커니즘을 기반으로 개발 되었습니다. (그림 1. 참조) 

 

Microplate Coating Service 보기


 

 

immobilization.png

 

 

 

그림 1. 고정화 방법의 3가지 메커니즘 비교 

 

 


2.  항원 & 항체


항원과 항체는 분석의 감도(sensitivity)와 특이성(specificity)을 결정하는 두 가지 주요 요소입니다. 항원의 순도(purity) 및 안정성(stability)은 

ELISA 분석에 영향을 주는 핵심 매개 변수(key parameter)로 항원의 높은 순도는 항체의 포착 능력을 향상시켜 분석의 감도를 증가시킬 수 

있습니다. 


항체의 Fab 부분에서 발견되는 항원-결합 부위(antigen-binding site)의 3차원적 배열(three dimensional configuration)은 항원과의 상호 작용

강도 및 특이성을 제어 합니다. 상호 작용 강도가 강할수록 낮은 농도의 항원 검출이 가능하게 됩니다. 경쟁 인자(competing factor)란 표적 

항원(target antigen) 이외의 혈청 단백질(serum proteins)에 대한 항체의 결합 또는 교차 반응성(cross-reactivity)의 특이성(specificity)을

지칭 합니다. 사용되는 항체가 다 클론(polyclonal) 혹은 단일 클론(monoclonal) 인지에 따라 서로 다른 힘에 의해 교차 반응성이 발생합니다.

어느 경우이든, 분석 민감도의 한계까지 분석을 하게 되면 교차 반응성을 야기하여 특이성이 낮아지는 결과를 얻게 됩니다.


샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA) 분석에는 포획 및 검출 항체로서 단일 클론 또는 다 클론 항체가 사용될 수 있습니다. 단일 클론 항체는

특정 항원에 대한 고유의 특이성을 갖는 단일 에피토프(epitope) 로 인해 특정 항원의 미세한 농도 차이도 정량화 될 수 있습니다. 샌드위치

ELISA 분석에서 다 클론 항체는 가능한 많은 양의 항원을 포획하기 위한 포획 항체로서 주로 사용 되며 단일 클론 항체는 검출 항체로서

사용되어 특이성을 증가시키는데 사용 됩니다.


샌드위치 ELISA 분석 설계 시, 고려해야 되는 중요한 점은 포획 및 검출 항체가 겹치지 않는 서로 다른 항원 에피토프를 인식 해야 하는 

점입니다. 항원이 포획 항체와 결합 할 때, 검출 항체와 결합 되어야 될 에피토프는 가려 지거나 변경되어서는 안됩니다. 서로 방해하지 않고 

항원의 에피토프에 동시에 결합 할 수 있는 포획 및 검출 항체를 "일치하는 항체 쌍(matched antibody pair)" 라고 하며 샌드위치 ELISA

분석에 적합 합니다.

 


Antigen 제품 보기  

Antigen Generation 서비스 보기 

 

Antibody 제품 보기

Antibody Pair Generation 서비스 보기

 

 


3.  컨쥬게이트 방법 (Conjugate Strategy)


효소 표지된 항체(enzyme labeled antibody)는 ELISA 신호 강도(signal output)를 결정 짓는 핵심 요소 입니다. 항체와 효소의 컨쥬게이션

(conjugation)은 항원 특이적인 단일 클론 또는 다 클론 항체 사이의 안정적인 공유 결합의 형성을 포함하는데, 여기서 항체의 항원 결합 

부위 또는 효소의 활성 부위는 기능적으로 변경되지 않습니다.


양고추냉이 과산화효소(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP) 와 같은 여러 가지의 다양한 리포터 효소는 각기 다른 커플링 화학(coupling 

chemistries)을 사용하여 항체와 단백질에 부착되어 효소와 단백질의 활성을 최대한 유지할 수 있습니다.


     양고추냉이 과산화 효소(HRP) - 디아 미노 벤지딘 (DAB) 또는 화학 발광과 같은 발색 반응에 의해 가시화 될 수 있습니다. HRP는

     분자량 44kDa 의 당 단백질 효소 표지(glycoprotein enzyme label)로서 알칼리성 포스파타제(AP)보다 더 안정적입니다.

     

     알칼리성 포스파타제 (AP) - 가수 분해 효소(hydrolase enzyme)로 비색 기질(colorimetric substrate)인 pNNP와 함께 사용 됩니다.


컨쥬게이션의 화학적 세부사항은 하기 문헌을 통해 살펴볼 수 있습니다. 

Winston, S. E., Fuller, S. A., Evelegh, M. J. and Hurrell, J. G. 2001. Conjugation of Enzymes to Antibodies. Current Protocols in 

Molecular Biology. 50:I:11.1:11.1.1–11.1.7. 

 


Secondary Antibody 제품 보기 

Enzyme Antibody Labeling and Conjugation 서비스 보기


 

 

4.  효소 및 크로모겐 (Enzyme and Chromogen) 


ELISA의 분석의 마지막 중요 요소로, 기질이 첨가 될 때 생성 된 신호의 강도는 검출 항체와 결합 된 항원의 양에 직접 비례 합니다. 

가장 일반적으로 사용되는 효소 및 기질은 다음과 같습니다.

 


표 2. ELISA에 사용되는 가장 일반적으로 사용되는 효소 및 기질/발색단과 관련 반응정지 액(stopping agents) 별 색상 변화


Enzyme and Chromogen_ELISA.PNG

 


 

ELISA 문제 해결 


ELISA 분석 시 야기되는 문제 점 (ex: 표준 곡선, 신호 강도, 높은 백그라운드, 큰 변동계수 값 등등..) 해결에 대한 자세한 내용이 

“ELISA Troubleshooting Tips” 에 기술되어 있습니다. 


 

Creative Diagnostics 사는 연구개발 및 IVD community를 위한 ELISA 개발 키트 서비스를 제공합니다. 규제 승인을 지원하기 위한 ELISA 

키트 개발 서비스를 수행 합니다. 승인을 위한 Proposal 을 제안하고 예상 결과 및 관련 문서를 제공합니다.


검출 방법 (Detection Methods):

 

 1)  흡광 (Light Absorbance)

 2)  형광 및 편광 (Fluorescence intensity or polarization)

 3)  형광공명에너지전이 (Fluorescence resonance energy transfer)

 4)  발광 (Luminescence)

 

분석 단계 (Assay Milestones):

 

 1)  타당성 평가 및 실험 설계

 2)  실험 최적화

 3)  실험 검증

 4)  제조 

 

ELISA Kit Development 서비스 보기 



[출처: Creative Diagnostics]