ELISA 가이드(Guide)    

ELISA 분석 원리 및 종류

개요 (Introduction)

효소 결합 면역 흡착 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)은 표지 면역 분석 기법(labeled immunoassay techniques)

중에서 가장 널리 사용되는 기법으로 고체 표면에 부착 된 항체 또는 항원을 정성, 정량 분석하는 간단하고 빠른 기술 입니다. 효소가

표지 된 항체(enzyme-labeled antibody)를 96 well 혹은 384 well 폴리스타이렌 플레이트(polystyrene plates)의 고체 표면에 고정 된

항원에 결합 시킨 후, 기질(subsrate)를 첨가하여 원 시료에 존재하는 항원의 양에 비례하는 색상 변화 / 광 신호(light signal)를 측정

합니다. 가장 민감한 면역 분석법 중 하나인 ELISA 실험은 환경, 식품 안전, 제약, 질병 바이오 마커 진단을 비롯한 다양한 연구, 산업

분야에 널리 사용되고 있습니다.

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ELISA 종류 (ELISA Format)

항원 고정 방법, 항체 표지 방법 그리고 항체-항원 반응(direct recognition or competition)에 따라 ELISA 분석은 다양한 형태로 분석 될 수

있습니다. 각각의 형태는 고유의 장,단점을 가지고 있어 실험 목적에 따라 최적의 ELISA 형태를 선택 합니다. 

1.  직접 ELISA (Direct ELISA)

가장 간단한 형태의 ELISA 분석으로 항원(antigen)을 플라스틱 고체상(plastic solid phase)에 부착 시키기 위해 일정 시간 동안 배양 합니다.

간단한 세척 단계 후, 효소와 공유 결합 된 항체를 첨가하여 항원을 검출 합니다. 배양 및 세척 후, 효소 활성이 색 변화를 일으키는 chromogen

혹은 기질을 넣어 주어 정해진 시간 후 혹은 chemical 에 의해 발색이 정지된 후에 분광 광도계를 이용하여 발색 정도를 측정 하여 원 시료에 

들어있는 항원을 정성, 정량 분석 합니다. 

그림 1. 직접 ELISA 법의 분석 흐름도

Direct ELISA는 하나의 항체만 이용하므로 시료, 항체 스크리닝 및 에피토프 맵핑(epitope mapping)에서 정성적 / 정량적 항원 검출에

유용합니다. 교차 반응성(cross reactivity)을 갖는 2 차 항체를 사용하지 않아 더 짧은 시간에 분석이 됩니다. 그러나 효소 표지로 인해 1 차 

항체의 면역 반응성(immunoreactivity)이 감소 될 수 있으며, 표지 된 일차 항체는 일반적으로 사용되지 않아 Direct ELISA 사용 시, 각각의 

ELISA 분석 기법에 특이적인 표지 된 일차 항체가 필요합니다. 

2.  간접 ELISA (Indirect ELISA)

Direct ELISA 분석법에 기초한 Indirect ELISA분석은 가장 널리 사용되고 있는 ELISA 형태 중 하나로 검출을 위해 표지 된 1차 항체가 생성 된 

종(species)에 특이적인 2차 항체를 추가로 이용 합니다. 항원을 각 웰(well)에 부착 시키기 위해 일정 시간 동안 배양 합니다. 각 웰에 부착되지

않은 항원을 세척(wash)하여 제거한 후, 항원 특이적인 1차 항체를 항원과 함께 배양 합니다. 항원과 결합되지 않은 1차 항체를 세척하여 

제거한 후, 효소와 공유 결합 된 anti-species 2차 항체를 각 웰에 넣어 주어 항원과 결합되어 있는 1차 항체에 결합 합니다. 배양 및 세척 후, 

효소 활성이 색 변화를 일으키는 기질(substrate)을 넣어주어 발색 정도를 측정 합니다. 

그림 2. 간접 ELISA 법의 분석 흐름도 

Direct ELISA와 같이 Indirect ELISA 는 항체 스크리닝, 에피토프 맵핑(epitope mapping) 및 단백질 정량에 매우 유용하게 사용 됩니다. 

2차 항체는 1차 항체의 signal을 증가 시켜주어 Direct ELISA 대비 높은 민감도를 제공 합니다. 그러나 2차 항체에 의한 교차 간섭으로 

인해 더 높은 background signal를 야기하여 잠재적으로 전체적인 signal 강도가 떨어질 수 있습니다.  

Direct ELISA 와 Indirect ELISA 비교

3.  샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA)

Sandwich ELISA 는 가장 유용한 면역 분석 법 중 하나로 가용성 항원(soluble antigen)의 검출을 위해 고안 되었습니다. 사용된 항체의

갯수(number)에 따라 Direct Sandwich ELISA와 Indirect Sandwich ELISA 로 구분되며, Sandwich ELISA 는 Direct ELISA와는 반대로 

고체상에 포획 항체(capture antibody)를 먼저 고정시키어 항원을 포획(capture) 합니다.

Direct Sandwich ELISA (그림 3a) 는 포획 항체(capture antibody)가 고체상에 먼저 부착 됩니다. 고체상에 부착 되지 않은 과잉(excess)의

포획 항체를 세척한 후, 항원을 넣어 주어 포획 항체와 결합을 시킵니다. 마지막으로 효소가 표지된 2차 항체(second enzyme labeled 

antibody)를 넣어 주어 항원을 검출 합니다. 이러한 형태의 분석은 단일 종 항혈청(single species antiserum)이 이용 가능하고 항원이 

플레이트에 잘 부착되지 않은 경우에 유용 합니다.

Indirect Sandwich ELISA (그림 3b) 의 경우, 항원은 표지 되지 않은 두 번째 항체(second unlabeled antibody)로 우선 포획 되며, 이러한 

두 번째 항체는 항-종 효소가 표지된 컨쥬게이트 (anti-species enzyme labeled conjugate)에 의해 포획 됩니다. 항-종 컨쥬게이트가 포획 

항체에 결합되지 않는 것이 필수적이므로, 포획 항체가 생성되는 종(species)은 반드시 항-종 컨쥬게이트 와는 구분되어야 하며, 항원은 

“Sandwich” 결합을 허용하는 2개의 antigenic sites 를 가지고 있어야 합니다. 이러한 Indirect Sandwich ELISA 법은 단일 항-종 

컨쥬게이트 (single anti-species conjugate)로 여러 시료의 항체 결합을 평가할 수 있다는 장점이 있습니다.

그림 3. Direct Sandwich ELISA(a) 와 Indirect Sandwich ELISa (b) 법의 분석 흐름도

Sandwich ELISA 법은 저 농도 및 다른 단백질로 오염되어 있는 항원의 검출에 유용 합니다. 만약 이러한 특성의 항원들을 Direct ELISA 혹은 

Indirect ELISA 법으로 분석하게 되면 충분한 양의 항원이 고체상에 부착되지 않아 결과 해석에 어려움이 있습니다. Sandwich ELISA 법에 

사용되는 항원은 최소한 2개의 항체와 결합할 수 있는 2개의 antigenic sites 를 반드시 가지고 있어야 합니다.  

4.  경쟁적 ELISA (Competitive ELISA)

상기에 소개 된 ELISA 분석 형태들은 그림. 4 에 기술 된 바와 같이 경쟁 또는 억제 조건을 적용하여 항원 또는 항체를 측정하도록 설계 될 수 

있습니다.

최적의 ELISA 분석 조건을 얻기 위해서는 항원과 항체를 결합 시키는 과정이 필요 합니다. 경쟁적 ELISA형태에서는 이러한 분석 조건 과정에 

표지된 항원 (그림. 4a) 또는 항체 (그림. 4b)을 첨가하여 분석하고자 하는 표지가 되지 않은 미지 시료의 항원 또는 항체와 경쟁적으로 결합 

되도록 유도 합니다. 세척 단계 후, 발색 기질(chromophore substrate)을 첨가하여 표지된 경쟁 항체 또는 항원 생성 된 신호(색상 변화 또는

빛의 세기)를 측정 합니다. 경쟁 항체 또는 항원의 인한 신호 변화를 측정하여 미지 시료의 항원/항체의 농도 정보를 얻을 수 있습니다. 

그림 4. 항원 경쟁 ELISA (a) 및 항체 경쟁 ELISA (b) 의 분석 흐름도

경쟁적 ELISA는 복잡한 혼합물에 들어있는 항원을 측정하는데 유용하게 사용 됩니다. 항원의 농도를 이미 알고 있는 유사한 시료(similar 

sample)와 비교하여 미지의 시료(unknown sample)에 들어있는 특정 항원의 농도를 측정 할 수 있습니다.  

일반적인 ELISA 분석 프로토콜

각각의 경우에 정확한 분석 조건은 특정 분석에 맞게 최적화 되어야 합니다.

   [ 출처: Creative Diagnostics ]